Домой

Весь курс предусматривает 36 занятий, из них 23 занятия помещены в первой части пособия и 13 во второй. Теоретическая часть включает перечень учебных вопросов, рассматриваемых по данной теме, которые должен знать студент




НазваниеВесь курс предусматривает 36 занятий, из них 23 занятия помещены в первой части пособия и 13 во второй. Теоретическая часть включает перечень учебных вопросов, рассматриваемых по данной теме, которые должен знать студент
страница2/9
Дата03.04.2013
Размер1.29 Mb.
ТипДокументы
Лабораторные работы
Принцип метода.
Ход работы.
Выводы по результатам работы.
Ход работы.
Выводы по результатам работы.
ВНИМАНИЕ! Соблюдать меры безопасности при работе с гидроксидом натрия и нагреванием.
Выводы по результатам работы.
ВНИМАНИЕ! Соблюдать меры безопасности при работе с кипящей водяной баней.
Выводы по результатам работы.
Выводы по результатам работы.
Ход работы.
Количественное определение активности амилазы мочи по Вольгемуту
Ход работы.
Клинико-диагностическое значение.
Вывод (записать полученный результат и дать его клинико-диагностическую оценку).
Подобные работы:
1   2   3   4   5   6   7   8   9

Исходный уровень знаний и навыков


Студент должен знать:

  1. Теоретические основы химической кинетики.

  2. Строение моносахаридов. Качественные реакции на альдегидные и спиртовые группы.

  3. Строение полисахаридов. Свойство и качественные реакции.

  4. Механизм образования шиффовых оснований.

  5. Строение и механизм катализа коферментами NAD+ и NADP+.


Студент должен уметь:

  1. Проводить качественные реакции на продукты ферментативного гидролиза.

Структура занятия


  1. Теоретическая часть

    1. Свойства ферментов (термолабильность, специфичность и др.). Механизм действия ферментов. Этапы взаимодействия фермента и субстрата. Гипотезы Э. Фишера, Д. Кошланда и современные взгляды.

    2. Теория промежуточных соединений. Основы термодинамики катализа. Энергия активации. Энергетический барьер.

    3. Кинетика ферментативных реакций (факторы, влияющие на скорость ферментативных реакций: природа фермента и субстрата, их концентрация, pH, температура, лекарственные препараты и др.). Km – определение, физиологическое значение.

    4. Регуляция активности ферментов. Роль гормонов, цАМФ, активаторов, ингибиторов. Регуляция активности путем химической модификации ферментов (ограниченный протеолиз, фосфорилирование, метилирование и др.). Виды ингибирования. Аллостерическая регуляция и свойства аллостерических ферментов.

  2. Практическая часть

    1. Решение задач и проведение контроля конечного уровня знаний.

    2. Лабораторные работы.


Задачи

1 Аскорбиновая кислота необходима для синтеза и функционирования коллагена и потребляется в реакциях, катализируемых: а) лизил-гидрокси­лазой; б) лизил-оксидазой; в) пролил-гидроксилазой; г) АСТ?

2 Каталитическое действие ферментов связано:

а) с увеличением энергии активации;

б) уменьшением энергии активации;

в) увеличением свободной энергии реакции;

г) уменьшением свободной энергии реакции?

3 Какие ферменты активируются из зимогенов: а) карбоксипептидаза; б) химотрипсин; в) пепсин; г) трипсин; д) ЛДГ; е) АСТ?

4 В катализируемой реакции фермент:

а) увеличивает скорость реакции в обоих направлениях;

б) смещает равновесие по направлению к продукту реакции;

в) снижает энергию активации;

г) уменьшает значение свободной энергии;

д) изменяет константу Михаэлиса?

^ Лабораторные работы


Лаборатоpная работа № 1. Изучение действия ферментов


Действие липазы.

Липаза входит в состав сока поджелудочной железы. В желудочном соке она содержится в небольшом количестве и действует только на предварительно эмульгированные жиры. В кишечнике желчные кислоты и белки способствуют эмульгированию липидов. Действие липазы можно обнаружить, добавив ее раствор к молоку, предварительно слабо подщелоченному раствором карбоната натрия в присутствии фенолфталеина, дающего бледно-розовую окраску.

^ П
ринцип метода.
Липаза ускоряет гидролиз нейтрального жира на глицерин и жирные кислоты (см. уравнение), что приводит к снижению pH и исчезновению розовой окраски индикатора – фенолфталеина.


^ Ход работы. В две пробирки наливают по 10 капель молока. В 1-ю пробирку добавляют 5 капель панкреатина, содержащего липазу, во 2-ю – 5 капель воды. В обе пробирки наливают по 1 капле 0,5 %-го раствора фенолфталеина и по каплям 1 %-го раствора карбоната натрия до появления бледно-розовой окраски при pH 8,0 (нельзя приливать избыток раствора карбоната натрия). Пробирки помещают в термостат при температуре 38 °С на 30 мин. Наблюдают обесцвечивание раствора в пробирке, содержащей липазу.

^ Выводы по результатам работы.


Действие уреазы.

Принцип метода. Уреаза катализирует гидролиз мочевины на двуокись углерода и аммиак (см. уравнение), что приводит к увеличению pH, которое регистрируется индикатором – фенолфталеином.





^ Ход работы. Берут две пробирки. В 1-ю отмеривают 1мл 1 %-го раствора мочевины, а во 2-ю   1мл 1 %-го раствора тиомочевины. В каждую пробирку добавляют по 2 капли фенолфталеина и по 1 мл раствора уреазы. Содержимое обеих пробирок встряхивают, оставляют на несколько минут при комнатной температуре и наблюдают за появлением розовой окраски в пробирке с мочевиной и отсутствием окраски в пробирке с тиомочевиной. Содержимое 1-й пробирки приобретает розовую окраску вследствие смещения pH раствора в щелочную сторону за счет образования аммиака.

^ Выводы по результатам работы.


Лаборатоpная работа № 2. Изучение влияния различных факторов на скорость ферментативных реакций (УИРС).


Скорость ферментативных реакций зависит от многих факторов: концентрации субстрата и фермента, pH среды, наличия активаторов и ингибиторов, коферментов и концентрации ионов в реакционной среде.

Фермент -амилаза содержится в слюне и катализирует гидролиз (1-4) гликозидной связи крахмала и гликогена до дисахарида мальтозы. Кроме того, в слюне имеется фермент мальтаза, расщепляющий мальтозу до глюкозы. Гидролиз крахмала под действием -амилазы происходит до стадии образования декстринов. Нерасщепленный крахмал с йодом дает синее окрашивание. Декстрины в зависимости от размера дают с йодом синее окрашивание, амилодекстрины – фиолетовое, эритродекстрины – красно-бурое, ахродекстрины и мальтоза – желтое. Конечные продукты гидролиза крахмала – мальтоза и глюкоза имеют свободные альдегидные группы и могут быть обнаружены реакцией Троммера, в основе которой лежит окислительно-восстановительная реакция. При этом альдегидная группа окисляется до глюконовой кислоты, а медь – в гидрат окиси меди желтого цвета. При дальнейшем нагревании гидрат закиси меди переходит в красную закись меди.

Одним из характерных свойств ферментов является термолабильность, т. е. чувствительность фермента к температуре, при которой протекает ферментативная реакция. Для многих ферментов температурный оптимум составляет 38–40 °С.

При нагревании выше 70 °C вследствие тепловой денатурации белковой молекулы ферменты утрачивают свои свойства. Степень инактивации зависит от длительности теплового воздействия. При низких температурах ферменты хорошо сохраняются, но скорость ферментативного процесса резко снижается. В термолабильности ферментов можно легко убедиться на примере действия амилазы слюны. О действии фермента судят по исчезновению субстрата или появлению продуктов реакции.


Реакция Троммера.


^ ВНИМАНИЕ! Соблюдать меры безопасности при работе с гидроксидом натрия и нагреванием.

Ход работы. К 5 каплям неразведенной слюны прибавляют 3 капли крахмала, 5 капель 10 %-го раствора едкого натра и 3 капли 1 %-го раствора сульфата меди. Дают постоять при комнатной температуре 15 мин. Затем осторожно нагревают до закипания. Появление красного окрашивания указывает на положительную реакцию Троммера.

^ Выводы по результатам работы.


Влияние температуры на активность амилазы.

Расщепление крахмала амилазой можно наблюдать, используя реакцию с йодом.


^ ВНИМАНИЕ! Соблюдать меры безопасности при работе с кипящей водяной баней.


Ход работы.

1 Наливают в 4 пробирки по 0,5 мл раствора крахмала. Еще в 4 пробирки наливают по 0,5 мл разбавленной (1 : 10) слюны.

2 Берут первую пару пробирок (одна – с ферментом, другая – с крахмалом) и помещают на баню со льдом. Вторую пару оставляют при комнатной температуре. Третью пару помещают в термостат (40 °C), а четвертую – в кипящую водяную баню.

3 Через 10 мин содержимое каждой пары пробирок сливают вместе, тщательно перемешивают и оставляют стоять еще 10 мин в тех же условиях.

4 Из 3-й пробирки отбирают 3 капли жидкости и проделывают реакцию с каплей йода на стекле. Если появляется синее окрашивание, растворы оставляют стоять еще 10 мин, и после этого повторяют реакцию с йодом на стекле. Затем добавляют 2 капли раствора йода во все пробирки и наблюдают за появлением окрашивания.

^ Выводы по результатам работы.


Влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы.


Ход работы.

1 В одну пробирку вносят 10 капель дистиллированной воды, а во 2-ю – 8 капель воды и 2 капли 1 %-го раствора хлорида натрия, в 3-ю – 8 капель воды и 2 капли раствора сульфата меди.

2 В каждую пробирку добавляют по 20 капель разведенной слюны (1 : 10), пробирки перемешивают, добавляют по 5 капель раствора крахмала и оставляют стоять при комнатной температуре 5 мин.

3 Тем временем готовят 3 пробирки с водой (по 1 мл), подкрашенной каплей раствора йода, и добавляют в них по 3 капли содержимого опытных проб. Наблюдают окрашивание в зависимости от степени расщепления крахмала амилазой. В 1-й пробирке появляется фиолетовая или красно-бурая окраска, во 2-й пробирке, где ионы хлора играют роль активатора, появляется желтая окраска, а в 3-й, где ионы меди тормозят действие амилазы, – окраска остается синей. Если описанная картина не наблюдается, то опыт повторяют через 10–15 мин.

^ Выводы по результатам работы.


Влияние pH на активность амилазы слюны.

Оптимум pH для действия амилазы слюны можно определить при взаимодействии ее с крахмалом при различных значениях pH среды. О степени расщепления крахмала можно судить по реакции крахмала с йодом в течение времени. При оптимальном значении pH расщепление крахмала произойдет полностью (окраска с йодом отсутствует). По мере удаления от точки pH в кислую или щелочную сторону произойдет лишь частичное расщепление крахмала до стадии декстринов (красно-бурая или фиолетовая окраска) или крахмал вообще расщепляться не будет (синяя окраска).

^ Ход работы.

1 В 4 пронумерованные пробирки отмеривают отдельными пипетками по 2 мл фосфатного буфера с различным значением pH (6,0; 6;4, 6,8; 7,4).

2 В каждую пробирку добавляют по 1 мл раствора крахмала и по 0,5 мл разбавленной (1 : 10) слюны, которые помещают в термостат на 10 мин при 38 °С.

3 Из каждой пробирки каплю жидкости смешивают с каплей раствора йода на предметном стекле и сравнивают окрашивание в каждой пробирке. Повторяют эту пробу через 1-2 мин до тех пор, пока проба из 5-й пробирки даст с йодом на стекле красно-бурое окрашивание. Через 1-2 мин после этого во все пробирки добавляют по 2-3 капли раствора йода (начинать с 1-й пробирки). Содержимое пробирок хорошо взбалтывают. Сравнивают между собой окрашивание во всех пробирках и делают вывод о степени расщепления крахмала, а следовательно, об активности фермента при этом значении pH среды.

Выводы по результатам работы.


Рекомендуемая литература

Основная

  1. Материал лекций.

  2. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1990. С. 105–123; 1998. С. 143–156.

  3. Николаев А. Я. Биологическая химия. М.: Высшая школа, 1989. С. 52–92.

Дополнительная

  1. Марри Р. и др. Биохимия человека. М.: Мир, 1993. Т. 1. С. 76–110.

  2. Филиппович Ю. Б. Основы биохимии. М.: Высшая школа, 1993. С. 100–111.

  3. Ленинджер А. Л. Основы биохимии. М.: Мир, 1985. Т. 1. С. 226–302.

  4. Албертс Б. и др. Молекулярная биология клетки. М.: Мир, 1994. Т. 1. С. 113–171.

Занятие 4

Номенклатура и классификация ферментов. Медицинская энзимология

Цель занятия: сформировать представления о принципах номенклатуры и классификации ферментов, основных аспектах и проблемах медицинской энзимологии. Научиться определять активность амилазы в моче.


Исходный уровень знаний и навыков


Студент должен знать:

  1. Строение клетки и основных органелл.

  2. Понятие о мутациях и механизмах мутагенеза. Основные этапы биосинтеза белка.

  3. Принципы и методы измерения скорости химических реакций.


Студент должен уметь:

  1. Выполнять качественные реакции на активность ферментов биологических жидкостей.


Структура занятия


  1. Теоретическая часть

    1. Локализация ферментов в клетке (клеточная мембрана, цитоплазма, митохондрии, ядро, лизосома, рибосомы). Маркерные ферменты. Органно­специфические ферменты. Выделение и очистка ферментов. Качественное обнаружение и количественное определение. Единицы измерения количества и активности ферментов. Номенклатура и классификация.

    2. Изоферменты, их биологическая роль. Полиферментные комплексы. Понятие о метаболоне.

    3. Изменение активности ферментов в онтогенезе.

    4. Основные направления клинической энзимологии.

      1. Энзимопатии. Определение. Классификация. Первичные (наследственные) энзимопатии. Причины возникновения. Механизм развития метаболических нарушений при энзимопатиях. Степень клинических проявлений энзимопатий. Вторичные (приобретенные) – токсические, алиментарные энзимопатии. Причины возникновения. Механизм развития метаболических нарушений. Клинические проявления.

      2. Энзимодиагностика, принципы и объекты энзимодиагностики (кровь, моча, слюна, ликвор, пот и др.). Характеристика основных ферментов сыворотки крови (клеточные, секреторные и экскреторные). Типы изменения активности ферментов при патологии (гипо-, гипер- и дисферментемия). Задачи энзимодиагностики.

      3. Энзимотерапия. Использование ферментов для заместительной терапии. Лечение хирургических, сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний. Иммобилизованные ферменты. Липосомы и их применение.

      4. Использование ферментов в лабораторной практике для определения концентрации субстратов и активности ферментов.

      5. Использование ферментов в промышленности и производстве.

  2. Практическая часть

    1. Решение задач.

    2. Лабораторная работа.

    3. Проведение контроля конечного уровня знаний.


Задачи

1 Изоферменты ЛДГ различаются:

а) по электрофоретической подвижности; б) Km для ПВК; в) числу субъ­единиц; г) субстратной специфичности; д) органной локализации?

2 Какие из свойств ферментов плазмы крови можно использовать с целью диагностики:

а) молекулярную массу и его электрофоретическую подвижность;

б) значение Km для субстратов;

в) чувствительность к действию активаторов и ингибиторов, а также к условиям среды;

г) энергию активации;

д) оптимум pH?

3 О каких заболеваниях свидетельствует увеличение активности перечисленных ферментов в плазме крови (найти соответствие):

А) АСТ;

а) костные заболевания;

Б) АЛТ;

б) острый гепатит;

В) щелочная фосфатаза;

в) холестаз;

Г) кислая фосфатаза;

г) аденома простаты;

Д) 5-нуклеотидаза;

д) инфаркт миокарда?

4 Ингибиторами каких ферментов являются указанные соединения:

А) диизопропилфторфосфат;

а) ДНК-полимераза;

Б) парахлормеркурийбензоат;

б) ацетилхолинэстераза;

В) малонат;

в) ферменты с каталитически активной SH-группой;

Г) фторурацил;

г) цитохромоксидаза;

Д) цианид;

д) сукцинат-ДГ?

5 В структуру каких ферментов входят соединения:

А) FAD;

а) пируваткарбоксилаза;

Б) пиридоксальфосфат;

б) ЛДГ;

В) ТПФ (кокарбоксилаза);

в) АСТ;

Г) биотин;

г) оксидаза аминокислот;

Д) NAD+;

д) ПВК декарбоксилаза?


Лаборатоpная работа ^ Количественное определение активности амилазы мочи по Вольгемуту


Принцип метода. Определение активности амилазы в биологических жидкостях (моча, ликвор, слюна, сыворотка крови) основано на определении минимальной активности (количества) фермента, катализирующего в стандартных условиях гидролиз добавленного крахмала. Амилазная активность мочи выражается количеством миллилитров крахмала, которое расщепляется ферментом, содержащимся в 1 мл неразведенной мочи, при температуре 45 ºC за 15 мин.

^ Ход работы. Берут 10 пронумерованных пробирок и приливают в каждую по 1 мл физиологического раствора. Затем в 1-ю пробирку добавляют 1 мл исследуемой мочи. Содержимое этой пробирки перемешивают, несколько раз втягивая и выпуская жидкость из пипетки. Набирают в пипетку 1 мл смеси и переносят во 2-ю пробирку, и процедуру повторяют вплоть до 10-й пробирки. Из 10-й пробирки 1 мл смеси отбрасывают. При этом получается следующее разведение мочи:


№ пробирки

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Разведение

1:2

1:4

1:8

1:16

1:32

1:64

1:128

1:256

1:512

1:1024

Гидролиз крахмала
































В каждую пробирку добавляют по 1 мл физраствора и по 2 мл 0,1 % раствора крахмала. После перемешивания содержимого пробирки термостатируют 15 мин при температуре 45 °С. После инкубации пробирки охлаждают водопроводной водой и ставят в штатив по порядку. Прибавляют в каждую пробирку по 1 капле раствора йода и перемешивают. Отмечают пробирку с наибольшим разведением мочи, при котором произошло полное расщепление крахмала с йодом. Полученные данные заносят в таблицу.

Расчет. Предположим, что полный гидролиз крахмала произошел в первых 4 пробирках. В четвертой пробирке (где разведение мочи 1 : 16) 1/16 мл мочи гидролизует 2 мл 0,1 %-го крахмала. Значит, 1 мл неразведенной мочи расщепит 32 мл 0,1 %-го крахмала. Следовательно, активность амилазы мочи равна 32 единицам. В норме активность амилазы мочи равна 16–64 единицам.

^ Клинико-диагностическое значение. Определение активности амилазы мочи и сыворотки крови широко используется в клинической практике для диагностики заболеваний поджелудочной железы. При острых панкреатитах амилазная активность мочи и сыворотки крови увеличивается в десятки раз, особенно в первые сутки заболевания, а затем постепенно возвращается к норме. При почечной недостаточности амилаза в моче отсутствует. В детском возрасте увеличение активности амилазы наблюдается при эндемическом паротите, что указывает на одновременное поражение поджелудочной железы вирусом паротита.

^ Вывод (записать полученный результат и дать его клинико-диагностическую оценку).


Рекомендуемая литература

Основная

  1. Материал лекций.

  2. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1990. С. 126–132; 1998. С. 157–168.

  3. Николаев А. Я. Биологическая химия. М.: Высшая школа, 1989. С. 52–92.

Дополнительная

  1. Марри Р. и др. Биохимия человека. М.: Мир, 1993. Т. 1. С. 63–75.

  2. Филиппович Ю. Б. Основы биохимии. М.: Высшая школа, 1993. С. 105–144.

  3. Врожденные и приобретенные энзимопатии / Под ред. Ташева Т. М.: Медицина, 1980.

  4. Вилкинсон Д. Принципы и методы диагностической энзимологии. М.: Медицина, 1981.

  5. Руководство по клинической лабораторной диагностике. Киев: Вища школа, 1990. С. 167–186.

  6. Зилва Ф., Пеннел Дж. Клиническая химия в диагностике и лечении. М.: Медицина, 1986. С. 372–388.

1   2   3   4   5   6   7   8   9

Поиск по сайту:



База данных защищена авторским правом ©dogend.ru 2014
При копировании материала укажите ссылку
обратиться к администрации
Уроки, справочники, рефераты