Домой

Экспрессия регуляторных генов Fgf 2, Pax 6, Six 3, Otx 2, Pitx 1 и Pitx 2 в эпиморфной регенерации сетчатки глаза у тритона Pleurodeles waltl. 03. 03. 05 биология развития, эмбриология




Скачать 249.44 Kb.
НазваниеЭкспрессия регуляторных генов Fgf 2, Pax 6, Six 3, Otx 2, Pitx 1 и Pitx 2 в эпиморфной регенерации сетчатки глаза у тритона Pleurodeles waltl. 03. 03. 05 биология развития, эмбриология
Дата07.02.2013
Размер249.44 Kb.
ТипАвтореферат диссертации
Содержание
Научный руководитель
Глазков Михаил Васильевич Ведущая организация
Общая характеристика работы
Материалы и методы исследования
Иммунохимические методы.
Вестерн-блот гибридизация
Молекулярно-генетические методы.
Синтез первой цепи кДНК
Праймеры и зонды для ОТ-ПЦР и ПЦР в реальном времени конструировали
ПЦР в реальном времени
Статистическая обработка данных.
Результаты исследования и их обсуждение
Экспрессия регуляторных генов
Динамика экспрессии регуляторных генов Fgf2, Pax6 и Otx2 в процессе трансдифференцировки клеток пигментного эпителия сетчатки тр
Локализация регуляторных факторов Fgf2, Pax6, Otx2, Pitx2 и рецептора Fgfr в интактных тканях глаза тритона и при регенерации се
Рис. 3. Результаты Вестерн-блот анализа специфичности реакции антител к Otx2, Pax6 и Pitx2 с белками из тканей глаза взрослого т
Рис. 4. Локализация белков Fgf2, Fgfr, Pax6 и Otx2 в интактных тканях глаза тритона.
Рис. 6. Локализация белка Pitx2 в интактных тканях глаза тритона
Рис. 9. Локализация белков Pax6, Otx2 и Pitx2 в тканях глаза тритона на 50 сутки регенерации сетчатки.
Pitx1 как в интактной, так и в регенерирующей сетчатке глаза взрослого тритона.
...
Полное содержание
Подобные работы:

На правах рукописи




АВДОНИН ПЕТР ПАВЛОВИЧ


Экспрессия регуляторных генов
Fgf2, Pax6, Six3, Otx2, Pitx1 и Pitx2 в эпиморфной регенерации
сетчатки глаза у тритона Pleurodeles waltl
.


03.03.05 – биология развития, эмбриология


Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук


Москва 2010


Работа выполнена в лаборатории проблем регенерации Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.


^ Научный руководитель:

доктор биологических наук Григорян Элеонора Норайровна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Онищенко Галина Евгеньевна

доктор биологических наук ^ Глазков Михаил Васильевич

Ведущая организация: Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, кафедра эмбриологии


Защита диссертации состоится «20» октября 2010г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 002.238.01 в Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26).

Сайт: http://idbras.comcor.ru/indexr.htm.

e-mail: idbras@bk.ru.


С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.


Автореферат разослан «20» сентября 2010 года.


Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

ele0806@mail.ru Е.Б. Абрамова

^ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение молекулярно-генетических механизмов регенерации тканей глаза является одной из фундаментальных задач биологии развития и медицины. У большинства позвоночных животных и человека регенерация сетчатки возможна лишь на ранних этапах эмбриогенеза. Некоторые низшие позвоночные – рыбы и тритоны, напротив, сохраняют способность к полному восстановлению сетчатки на протяжении всей жизни. Исследование молекулярно-генетических механизмов, лежащих в основе регенерации сетчатки у тритона, может дать ответ на вопрос о причине утраты высшими позвоночными и человеком этой способности. Информация о молекулярных механизмах регенерации сетчатки может быть использована в практических целях для восстановления сетчатки после повреждений.

Одним из путей исследований молекулярных механизмов регенерации сетчатки тритона является поиск и анализ экспрессии регуляторных генов, которые могут запускать и контролировать клеточные процессы, приводящие к её восстановлению. Регенерация сетчатки у взрослых тритонов происходит в результате трансдифференцировки клеток ретинального пигментного эпителия (РПЭ). После удаления сетчатки, клетки РПЭ дедифференцируются, пролиферируют и формируют популяцию нейробластов, которые впоследствии дают начало всем типам клеток регенерирующей сетчатки.

Показано, что в основе регенерации сетчатки глаза тритона лежат процессы клеточной пролиферации и дифференцировки, сходные с таковыми в ходе развития глаза. Это послужило основанием для предположения о сходстве набора генов, осуществляющих контроль в регенерации и развитии сетчатки.

В эмбриогенезе позвоночных ключевую роль в регуляции пролиферации и дифференцировки клеток сетчатки играют гены Fgf2, Pax6, Six3, Rx, Chx10, тогда как дифференцировка клеток РПЭ контролируется регуляторными генами Mitf, Otx2 и генами суперсемейства Tgfβ (Martinez-Morales et al., 2004; Zuber, Harris, 2006; Sigulinsky et al., 2008; Ohsawa, Kageyama, 2008). В контроль развития и дифференцировки сетчатки и РПЭ позвоночных могут быть также вовлечены регуляторные гены семейства Pitx (Chang et al., 2001; Evans, Gage, 2005; Маркитантова и др., 2006, 2008). В предшествующих исследованиях была показана экспрессия регуляторных генов Fgf2, Pax6, Six3, Chx10 и Otx2 в интактных тканях глаза тритонов и при регенерации сетчатки (Chiba, Mitashov, 2008). Тем не менее, данные об экспрессии регуляторных генов в регенерации сетчатки тритона, приводимые в современной литературе, немногочисленны и имеют разрозненный характер.

По этой причине несомненный интерес представляет детальное сравнительное исследование экспрессии регуляторных генов Fgf2, Pax6, Six3, Otx и генов семейства Pitx на хорошо разработанной модели регенерации сетчатки тритона Pleurodeles waltl.


Цель и задачи исследования. Цель работы заключается в исследовании молекулярно-генетических механизмов регуляции регенерации сетчатки тритона Pleurodeles waltl.

Были поставлены следующие задачи:

  1. Создать библиотеки кДНК, комплементарные мРНК из интактных тканей глаза и тканей глаза на последовательных стадиях регенерации сетчатки тритона P. waltl.

  2. Идентифицировать в геноме тритона P. waltl регуляторные гены Fgf2 и Pitx1.

  3. Провести сравнительный анализ экспрессии регуляторных генов Fgf2, Pax6, Six3, Otx, Pitx1 в интактных тканях глаза и тканях глаза на последовательных стадиях регенерации сетчатки тритона P. waltl методами ОТ-ПЦР и ПЦР в реальном времени.

  4. Провести сравнительный анализ локализации белков Fgf2, Pax6, Otx2, Pitx2 в интактных тканях глаза тритона P. waltl и при регенерации сетчатки методами иммунохимии.



Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые проведено сравнительное исследование экспрессии регуляторных генов Fgf2, Pax6, Six3, Otx2, Pitx1, Pitx2 и локализации белков Fgf2, Pax6, Otx2 и Pitx2 на последовательных стадиях регенерации сетчатки взрослого тритона. Проведён подробный количественный анализ экспрессии генов Fgf2, Pax6, Otx2 на последовательных стадиях трансдифференцировки клеток РПЭ. Выявлены закономерности в изменениях уровня экспрессии регуляторных генов Fgf2, Pax6, Otx2 в процессе трансдифференцировки. Высказано предположение о взаимодействиях исследуемых генов в регуляции процессов, приводящих к восстановлению сетчатки. Настоящая работа является фундаментальным исследованием, результаты которого вносят вклад в создание полной картины экспрессии генов в процессе трансдифференцировки клеток РПЭ и последующей регенерации сетчатки.

Используемые в работе стратегия и методы могут быть применены при разработке способов индукции регенерационных ответов клеток в поврежденной сетчатке высших позвоночных и человека. Результаты работы могут быть также использованы при разработке курса лекций по биологии развития и клеточной биологии.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы представлены на V Международной научно-практической конференции «Пролиферативный синдром в офтальмологии» (Москва, 2008), конференциях молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова (Москва, 2007, 2008), Европейской конференции по регенерации «Молекулярные и клеточные основы регенерации и восстановления тканей» (Palma de Mallorca, 2008), XV Школе «Актуальные проблемы биологии развития» (Звенигород, 2008), Международных конференциях «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2007, 2009), III Международной конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ. Из них 3 статьи в отечественных журналах, рекомендованных Перечнем ВАК, 3 статьи в научных сборниках и 5 тезисов международных конференций.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на __175 страницах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования, обсуждение результатов, заключение, выводы, список литературы. Иллюстративный материал содержит 28__ рисунков, _4___ таблиц. Список литературы включает _317 источник.


^ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. Объектом исследования служили взрослые тритоны Pleurodeles waltl в возрасте 9-ти месяцев (в количестве 200 животных), разводимые в аквариальной ИБР РАН. Образцы интактных и регенерирующих тканей глаза получали от наркотизированных в растворе MS-222 (1:1000) животных и проводили микрохирургическое выделение тканей изолированных интактных глаз, а также операции по удалению сетчатки через разрез в дорсальной области глаза по методу Стоуна (Stone, 1950). В работе выделялись образцы следующих тканей глаза: интактная сетчатка, интактный РПЭ, РПЭ на 8 и 14 сут после удаления сетчатки, суммарный образец регенерата сетчатки и РПЭ на 20 сут после удаления сетчатки, РПЭ и регенерат сетчатки на 50 сут после операции. Отметим, что во всех случаях РПЭ было возможно выделить только вместе с сосудистой оболочкой.

Фиксация тканей и приготовление криосрезов. Для иммуногистохимического анализа целые глаза в течение 4 ч фиксировали в 4% параформальдегиде на 0.1 М PBS (рH 7.4). Затем глаза отмывали в том же буфере и проводили по растворам сахарозы восходящей концентрации (5%, 10%, 20%). В 20% растворе образцы оставляли на ночь при 4°C. Из замороженных при -70ºС в смеси Tissue-Tec ОСТ (Leica, Германия) и 20% сахарозы на 0.1 М PBS (1:1) глаз получали поперечные срезы 10 мкм с помощью криостата. Для морфологических исследований (контроль стадии регенерации) использовали окрашенные гематоксилин-эозином срезы, приготовленные методами рутинной гистологии.

^ Иммунохимические методы.

Иммуногистохимия. В работе использовали коммерческие антитела к Fgf2 (Sigma, США, 1:30), Pitx2 (Sigma, США, 1:400), Pax6 (Abcam, Великобритания, 1:200), Otx2 (Abcam, Великобритания, 1:500). Криосрезы обрабатывали по стандартной методике. Вторые антитела были конъюгированы с флуорохромами - Aleksa 488 (Green) и Aleksa 546 (Red), (Molecular Probs, США, 1:1000). После реакции со вторыми антителами, срезы вновь отмывали и заключали в среду Vectashield (Vector, США). Ядра окрашивали Hoechst 33342. Окрашивание анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Leica DM RXA2 (Германия), оснащенного компьютерной приставкой и программой Leica for Windows. Изображения анализировали с помощью компьютерной программы Image J.

^ Вестерн-блот гибридизация. Для получения ядерных экстрактов препарированные ткани глаза лизировали в буфере RIPA (Radio Immuno Precipitation Assay buffer), содержащем: 150 мM хлорид натрия, 1% Тритон X-100, 0.5 % дезоксихолат натрия, 0.1 % SDS, 50мМ Трис, pH 8.0, 1мМ PMSF. Белок осаждали 10% ТХУ, количество белка в пробах определяли с помощью набора BSA (Pierce, США). После электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях, белки из геля переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Schleicher and Schuell, Германия) с использованием камеры Xcell II (Invitrogen, США). Иммунохимическую реакцию проводили с первыми антителами к Pitx2 (1:750), Pax6 (1:750), Otx2 (1:500), и со вторыми антителами против иммуноглобулинов кролика, конъюгированными с пероксидазой хрена (Cell Signaling Technology, США, 1:1000). Результат иммунохимической реакции визуализировали с помощью ECL–системы (Amersham Pharmacia Biotech, США).


^ Молекулярно-генетические методы.

Тотальную РНК из тканей глаза выделяли с помощью реактива TRI® Reagent (Sigma, США). Образцы тотальной РНК, выделенные из пигментированных тканей, очищали от примесей меланина по протоколу, предложенному Лагонигро (Lagonigro et al., 2004). Для исключения контаминации библиотек кДНК примесями геномной ДНК тотальную РНК обрабатывали ДНКазой “Turbo” (Ambion, США).

^ Синтез первой цепи кДНК. На тотальной РНК синтезировали первую цепь кДНК с использованием наборов Omniscript RT Kit (Quiagen,) и High Capacity RNA-to-cDNA Kit (Applied Biosystems, США). Были получены кДНК библиотеки из всех указанных в разделе «Объекты исследования» тканей глаза.

^ Праймеры и зонды для ОТ-ПЦР и ПЦР в реальном времени конструировали с помощью компьютерных программ DNAStar (США), Beacon Designer (США) и Primer Express (США) и анализа данных международной базы NCBI о структуре исследуемых генов. Праймеры для генов Fgf2, Pitx1 конструировали на основе гомологичных участков известных нуклеотидных последовательностей соответствующих генов у других видов амфибий и рыб. При конструировании праймеров для генов Otx2, Pax6 и Six3 использовали данные о структуре соответствующих генов тритона P. waltl. Для исключения получения ПЦР-продукта на матрице хромосомной ДНК, помимо обработки тотальной РНК ДНКазой, праймеры подбирали на основе анализа нуклеотидных последовательностей из разных экзонов с учетом требований для оптимальных условий проведения ПЦР в режиме реального времени. Праймеры были синтезированы фирмами «Литех», «Синтол» и «ДНК-Синтез» (Россия).

ОТ-ПЦР и анализ нуклеотидных последовательностей. Полуколичественную оценку и определение тканеспецифичности экспрессии исследуемых генов проводили методом ОТ-ПЦР со специфическими праймерами (Литех, Россия), на матрице кДНК, используя набор для амплификации, содержащий ColoredTaq полимеразу (Силекс М, Россия), и амплификатор Eppendorf Mastercycler (Eppendorf, Германия). ПЦР-продукты разделяли электрофорезом в агарозном геле (Amresco, США) в трис-ацетатном буфере с бромистым этидием (Sigma, США). Оценку интенсивности свечения продуктов ПЦР проводили на УФ-трансиллюминаторе (BIO-RAD, США) с помощью программы QuantityOne (BIO-RAD, США). Для секвенирования ПЦР-фрагменты элюировали из агарозы с помощью наборов GeneСlean (BIO 101 Inc., США) или MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen, Германия). При анализе нуклеотидных последовательностей использовали алгоритм Clustal W из пакета программ DNASTAR7 (DNASTAR Inc., США).

^ ПЦР в реальном времени. Для количественной оценки уровня экспрессии исследуемых генов, кДНК из анализируемых тканей (регенераты на 8, 14, 20 сутки после операции, интактные РПЭ и сетчатка) была предварительно отнормирована по генам Gapdh и Ef1a, т.н. “housekeeping genes” (Zhang et al., 2000). ПЦР в реальном времени проводили на ДНК амплификаторе «Applied Biosystems 7500» (Applied Biosystems, США) и «Rotor-Gene 3000» (CorbettResearch, Австралия). Использовали готовые компоненты реакции производства ЗАО «Синтол» (Россия). Рабочие концентрации специфических праймеров и зонда составляли 10 пкМ и 5пкМ, соответственно. Температурные и временные условия реакции отработаны эмпирическим путем.

^ Статистическая обработка данных. Каждую реакцию проводили не менее трех раз. Определяли значения Сt, полученные для каждого из анализируемых генов и генов эндогенного контроля. Данные считали достоверными при р<0,05, где р - показатель статистической значимости (достоверности) данных. Определение среднего арифметического значения, среднего квадратичного отклонения, ошибки средней арифметической и абсолютной вероятной погрешности проводили при помощи программы Microsoft Office Exсel 2007.


^ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Идентификация гомолога гена Fgf2. С помощью праймеров, сконструированных на основе гомологичных участков нуклеотидных последовательностей, соответствующих мРНК гена Fgf2 амфибий Xenopus laevis, Cynops pyrrhogaster, впервые был получен ПЦР-фрагмент (размером 252 н.п.) из кДНК тритона P. waltl. Секвенирование ПЦР-фрагмента и структурный анализ нуклеотидной последовательности, проведенный с помощью программы NCBI BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST), доказали его принадлежность гену Fgf2. Процент гомологии нуклеотидной последовательности полученного ПЦР-продукта с нуклеотидными последовательностями мРНК гена Fgf2 Bos taurus, Ovis aries и Cynops pyrrhogaster, составил 78.7%, 80.3% и 99.6%, соответственно. Процент гомологии аминокислотной последовательности, кодируемой полученным ПЦР-продуктом, с аминокислотными последовательностями белка Fgf2 B. taurus, O. aries и C. pyrrhogaster составил 86.7%, 89.2% и 100%, соответственно.

Идентификация гомолога гена Pitx1. С помощью праймеров, сконструированных на основе гомологичных участков нуклеотидных последовательностей, соответствующих гену Pitx1 Danio rerio, Gasterosteus aculeatus, X. laevis и X. tropicalis, был впервые получен ПЦР-фрагмент (размером 215 н.п.) из кДНК тритона P. waltl. Секвенирование ПЦР-фрагмента и структурный анализ нуклеотидной последовательности, проведенный с помощью программы NCBI BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST), доказал его принадлежность гену Pitx1. Процент гомологии нуклеотидной последовательности полученного ПЦР-продукта с нуклеотидными последовательностями мРНК гена Pitx1 G. aculeatus, D. rerio, Monodelphis domestica, X. laevis, X. tropicalis составил 85.2%, 87.1%, 87.4%, 88.8%, 90.2%, соответственно. Процент гомологии аминокислотной последовательности, кодируемой полученным ПЦР-продуктом, с аминокислотными последовательностями белка Pitx1 этих представителей позвоночных составил 100%, 97.2%, 97.2%, 97.2%, соответственно.

Таким образом, в ДНК тритона P. waltl впервые удалось идентифицировать гомологи двух генов Fgf2 и Pitx1, что дало возможность изучения экспрессии этих генов при регенерации сетчатки.


^ Экспрессия регуляторных генов Fgf2, Pax6, Six3, Otx2 и Pitx1 в интактной и регенерирующей сетчатке тритона.

Паттерн экспрессии генов Fgf2, Pax6, Six3, Otx2 и Pitx1, участвующих в формировании регуляторной сети «генов глазного поля» и играющих ключевую роль в развитии и дифференцировке клеток РПЭ и сетчатки, оценивали методом ОТ-ПЦР. В качестве маркёров дифференцировки клеток РПЭ и сетчатки были выбраны гены Rpe65, -II-tubulin и Rho. Анализ экспрессии генов Fgf2, Pax6, Otx2, Pitx1, Six3, Rpe65, -II-tubulin и Rho проводили на библиотеках кДНК из интактной сетчатки, интактного РПЭ, суммарного образца регенерата сетчатки с РПЭ и сосудистой оболочкой на 20 сут регенерации, регенерата сетчатки и РПЭ на 50 сут после операции. Обобщенные результаты ПЦР-анализа представлены на рисунке 1.





Рис.1. ПЦР-продукты, полученные с праймерами к генам Fgf2, Pax6, Six3, Otx2, Pitx1, Rpe65, -II-tubulin и Rho на кДНК библиотеках из следующих тканей:

1 – интактная сетчатка;

2 – интактный РПЭ;

3 – суммарный образец регенерата сетчатки с РПЭ; 20 сут после операции; 4 – регенерат сетчатки; 50 сут после операции;

5 – РПЭ; 50 сут после операции.



И в интактной сетчатке, и в сетчатке на 50 сут регенерации выявлена экспрессия гена маркёра нейральной дифференцировки -II-tubulin и гена маркёра дифференцировки фоторецепторов сетчатки Rho (рис.1 - 1, 4). В интактном РПЭ с сосудистой оболочкой и РПЭ с сосудистой оболочкой на 50 сут после операции выявлена экспрессия гена маркёра дифференцированных клеток Rpe65 (рис.1 - 2, 5). Эти данные свидетельствуют о том, что к 50 сут регенерации клетки РПЭ и некоторые типы клеток сетчатки достигли стадии терминальной дифференцировки.

В интактной сетчатке и сетчатке на 50 сут регенерации экспрессируются регуляторные гены Fgf2, Pax6, Otx2, Pitx1, и Six3 (рис.1 - 1, 4). В интактном РПЭ с сосудистой оболочкой и РПЭ с сосудистой оболочкой на 50 сут регенерации мы обнаружили экспрессию регуляторных генов Fgf2, Otx2 и Pitx1, но не выявили экспрессию генов Pax6 и Six3 (рис.1 - 2, 5).

Экспрессия регуляторных генов Fgf2, Pax6, Otx2, Six3 в клетках сетчатки и генов Fgf2, Otx2 в клетках РПЭ с сосудистой оболочкой на 50 сут регенерации предполагает участие данных генов в регуляции дифференцировки. Кроме того, впервые установлено, что в контроле процесса дифференцировки клеток сетчатки и РПЭ тритона может принимать участие ген Pitx1. Экспрессия регуляторных генов Fgf2, Pax6, Otx2, Six3 и Pitx1 в клетках сетчатки и генов Fgf2, Otx2 и Pitx1 в клетках РПЭ с сосудистой оболочкой сохраняется и после завершения их дифференцировки. Это позволяет предполагать участие данных генов не только в развитии тканей глаза, но и в регуляции функций, поддержании жизнеспособности и дифференцировки окончательно специализированных клеток сетчатки и РПЭ.

Показано, что на 20 сут после операции процесс трансдифференцировки клеток РПЭ завершается, сформированный малодифференцированными клетками регенерат сетчатки теряет плотные контакты с источником восстановления – слоем РПЭ и в обоих отделах начинается клеточная специализация. Методом ПЦР нами показано, что на данной стадии в суммарном образце экспрессируется ген Rpe65, и не экспрессируются гены -II-tubulin и Rho (рис.1 – 3). Эти результаты позволяют говорить о том, что процесс разделения слоя нейробластов сетчатки и РПЭ сопровождается началом редифференцировки клеток РПЭ, которая опережает дифференцировку нейробластов зачатка сетчатки.

В суммарном образце на 20 сут регенерации экспрессируются регуляторные гены Fgf2, Pax6, Otx2, Pitx1 и Six3 (рис.1 – 3). Опираясь на данные, полученные другими авторами при исследовании развития тканей глаза, мы можем предполагать, что сигнальный белок Fgf2 и транскрипционные факторы Pax6 и Six3 участвуют в поддержании малодифференцированного состояния и пролиферации клеток регенерата. Функции, выполняемые транскрипционным фактором Pitx1 на данной стадии, остаются невыясненными. Экспрессия регуляторного гена Otx2 в суммарном образце связана, по всей видимости, с участием этого гена в регуляции процесса редифференцировки клеток РПЭ.


^ Динамика экспрессии регуляторных генов Fgf2, Pax6 и Otx2 в процессе трансдифференцировки клеток пигментного эпителия сетчатки тритона.

На различных моделях in vivo и in vitro было показано, что функцию индуктора трансдифференцировки клеток РПЭ может выполнять сигнальный фактор Fgf2. В качестве источников этого фактора в нормальном глазу тритонов рассматривают сетчатку и сосудистую оболочку глаза, а после удаления сетчатки и хрусталика - сосудистую оболочку сетчатки и радужки, соответственно (McDevitt, 1997; Mitsuda et al., 2005). Было высказано предположение, что в ходе трансдифференцировки сигнальный фактор Fgf2 запускает цепь молекулярных взаимодействий, приводящих к подавлению экспрессии генов Otx2 и Mitf, контролирующих дифференцировку клеток РПЭ (Миташов, 2007). При этом экспрессия Fgf2 возможно находится в зависимости или, напротив, определяет экспрессию гена транскрипционного фактора Pax6, являющегося, в свою очередь, потенциальным ингибитором транскрипционных факторов Mitf и Otx2 (Миташов, 2007; Kuriyama et al., 2009). Однако, данных, доказывающих участие этих генов в трансдифференцировке клеток РПЭ взрослого тритона in vivo, в современной литературе нет.

Чтобы понять, возможны ли на ранних этапах трансдифференцировки клеток РПЭ взаимодействия между сигнальным белком Fgf2 и транскрипционным фактором Pax6 и между транскрипционными факторами Pax6 и Otx2, мы попытались выявить закономерности в изменениях уровня экспрессии кодирующих эти факторы генов. Для этого был проведён количественный анализ экспрессии регуляторных генов Fgf2, Pax6 и Otx2 в клетках интактного РПЭ с сосудистой оболочкой и на последовательных стадиях его трансдифференцировки (8, 14 сут), а также в суммарном образце зачатка сетчатки (20 сут). Результаты исследования представлены на рисунке 2.








Рис. 2. Уровень экспрессии генов Fgf2 (A), Pax6 (Б), Otx2 (В) в интактном РПЭ глаза и на ранних стадиях регенерации (относительно Gapdh и Ef1a).

1 – интактный РПЭ; 2 – РПЭ, 8 сут после операции; 3 – РПЭ, 14 сут после операции; 4 – суммарный образец, 20 сут после операции.


В интактном РПЭ экспрессируются регуляторные гены Fgf2 и Otx2, но не экспрессируется ген Pax6 (рис. 2 - А1, Б1, В1). Однако уже на 8 сут регенерации в РПЭ была выявлена экспрессия гена Pax6 (рис. 2 - Б2). Данная стадия соответствует началу дедифференцировки и пролиферации клеток РПЭ. На фоне экспрессии гена Pax6 наблюдалось снижение уровня экспрессии гена Fgf2 и резкое падение уровня экспрессии гена Otx2 по сравнению с интактной тканью (рис. 2 - А2, В2).

На 14 сут после удаления сетчатки, стадии, соответствующей росту пролиферативной активности дедифференцирующихся клеток РПЭ, наблюдалось снижение уровня экспрессии гена Pax6 относительно 8 сут (рис. 2 – Б2, Б3). Снижение уровня экспрессии гена Pax6, вероятно, связано с завершением процесса дедифференцировки клеток РПЭ. Уровень экспрессии генов Fgf2 и Otx2 либо соответствовал наблюдаемому на 8 сут, либо несколько его превышал (рис. 2 – А2, А3, В2, В3).

На 20 сут после удаления сетчатки мы отметили рост уровня экспрессии генов Fgf2, Pax6 и Otx2 относительно наблюдаемого на 14 сут (рис. 2 – A3, A4, Б3, Б4, В3, В4). Уровень экспрессии гена Fgf2 на данной стадии соответствовал уровню экспрессии в интактном РПЭ.

Выявленное нами отсутствие корреляций в изменениях уровней экспрессии генов Fgf2 и Pax6 на ранних этапах трансдифференцировки РПЭ дает основание предполагать, что прогресс трансдифференцировки клеток РПЭ, и, в частности, экспрессия в них гена Pax6 происходят независимо от сигнального фактора Fgf2. Тем не менее, мы не исключаем участие фактора Fgf2 в индукции трансдифференцировки клеток РПЭ и, в частности, активации экспрессии гена Pax6. Обнаруженная нами на 20 сут корреляция в уровне экспрессии генов Fgf2 и Pax6 в регенерате сетчатки, представленном активно пролиферирующими нейробластами, указывает на то, что Fgf2 участвует в поддержании как пролиферативной фазы, так и экспрессии гена Pax6 на поздних стадиях трансдифференцировки.


^ Локализация регуляторных факторов Fgf2, Pax6, Otx2, Pitx2 и рецептора Fgfr в интактных тканях глаза тритона и при регенерации сетчатки.

Поскольку в работе использовались коммерческие антитела к белкам Pitx2, Pax6 и Otx2 мыши и человека, был проведён анализ специфичности связывания данных антител с белками Pitx2, Pax6 и Otx2 тритона методом Вестерн-блот гибридизации. Показана специфичность окрашивания белка Pitx2 (35.4 кДа) в ядерных экстрактах клеток интактной роговицы (позитивный контроль), сетчатки и РПЭ с сосудистой оболочкой, белка Pax6 (46-48 кДа) в ядерных экстрактах клеток интактных сетчатки и роговицы и белка Otx2 (37 кДа) в ядерных экстрактах клеток интактных РПЭ и сетчатки (рис. 3).




^ Рис. 3. Результаты Вестерн-блот анализа специфичности реакции антител к Otx2, Pax6 и Pitx2 с белками из тканей глаза взрослого тритона. Иммунореактивность к полипептидам с соответствующей молекулярной массой (указана стрелками) выявлена в ядерном белковом экстракте из клеток сетчатки (1), РПЭ (2) и роговицы (3).


Локализация белков Fgf2, Fgfr, Pax6, Otx2 и Pitx2 в интактных тканях глаза тритона. В сетчатке неоперированного глаза мы выявили белковые продукты исследуемых регуляторных генов Fgf2, Pax6, Otx2, а также белок Fgfr, рецептор ростового фактора Fgf2, и показали отличия в распределении их в тканях глаза.

Белок Fgf2 был выявлен в цитоплазме клеток внутреннего ядерного слоя сетчатки, слоя ганглиозных клеток и в сетчатых слоях, а рецептор Fgfr - на поверхности клеток ганглиозного и внутреннего ядерного слоев сетчатки. Белок Pax6 обнаружен в ядрах клеток внутреннего ядерного и ганглиозного слоев, а Otx2 – в наружном ядерном слое, представленном телами фоторецепторов, в ганглиозных клетках и отдельных клетках внутреннего ядерного слоя. Белок Pax6 в интактном РПЭ не выявлен. Однако в клетках РПЭ обнаружен иммунопозитивный сигнал к белкам Otx2 (продукту гена - регулятора меланогенеза), Fgf2 и Fgfr (рис. 4).



^ Рис. 4. Локализация белков Fgf2, Fgfr, Pax6 и Otx2 в интактных тканях глаза тритона.

1 – слой ганглиозных клеток; 2 – внутренний сетчатый слой; 3 – внутренний ядерный слой;

4 – наружный сетчатый слой; 5 – наружный ядерный слой; 6 – РПЭ.


Эти данные указывают на способность клеток РПЭ поддерживать уровень пигментации и при этом воспринимать сигналы Fgf.

Наиболее выраженный иммуноспецифический сигнал к белкам Pax6 и Fgf2 был выявлен в клетках периферической части сетчатки, ростовой зоне, клетки которой сохраняют у тритона малодифференцированное состояние и пролиферативную активность в течение всей жизни (рис. 5).


Рис. 5. Локализация белков Fgf2 и Pax6 в ростовой области сетчатки неоперированного глаза тритона.

1 – цилиарный эпителий радужки; 2 – ростовая область сетчатки; 3 – слой ганглиозных клеток; 4 – внутренний ядерный слой.

Эти результаты согласуются с данными об участии Pax6 и Fgf2 в поддержании мультипотентного статуса и пролиферации клеток этой области глаза (Marquardt, Gruss, 2002; James et al., 2004; Mayer et al., 2005; Gamm et al., 2005).

Впервые в тканях глаза взрослого тритона выявлен белок Pitx2 методами иммуногистохимии и вестерн-блот гибридизации (рис. 3, рис. 6). В интактной сетчатке белок Pitx2 локализован в ядрах ганглиозных клеток и клеток внутреннего и наружного ядерных слоев (рис. 6).




^ Рис. 6. Локализация белка Pitx2 в интактных тканях глаза тритона.

1 – слой ганглиозных клеток; 2 – внутренний ядерный слой; 3 – наружный ядерный слой; 4 – РПЭ; 5 – цилиарный эпителий радужки; 6 – ростовая область сетчатки.


Белок Pitx2 как и другие изученные транскрипционные факторы был также обнаружен в клетках ростовой области сетчатки (рис. 6). Иммуноспецифическое окрашивание антителами к белку Pitx2 наблюдалось также в клетках РПЭ. Эти данные являются первым указанием на широкое присутствие данного транскрипционного фактора в тканях глаза тритона.

Локализация белков Fgf2, Fgfr, Pax6, Otx2 и Pitx2 в тканях глаза тритона на 20 сутки регенерации. Регенерат сетчатки на 20 сут представляет собой образовавшийся из РПЭ слой, состоящий из полностью или частично депигментированных клеток. Зачаток сетчатки этой стадии имеет толщину в 2-4 клетки и напоминает слой нейробластов, которые, как было показано ранее, интенсивно пролиферируют. На этой стадии восстановления сетчатки интенсивный иммуноспецифический сигнал к белку Fgf2 выявлен в цитоплазме, а к белку Fgfr – на поверхности клеток зачатка, а также отдельных клеток восстанавливающегося РПЭ и сосудистой оболочки (рис. 7).

Р
ис. 7. Локализация белков Fgf2, Fgfr, Pax6, Otx2 и Pitx2 в тканях глаза тритона на 20 сутки регенерации сетчатки.


1 – нейробласты раннего регенерата сетчатки; 2 – РПЭ; 3 – сосудистая оболочка.


Белки Pax6 и Otx2 были локализованы в ядрах депигментированных, пролиферирующих нейробластов (рис. 7). В клетках РПЭ на данной стадии белок Pax6 иммунохимически не детектируется. При этом здесь выявлен иммуноспецифический сигнал к белку Otx2 (рис. 7).

Локализация белков Fgf2 и Pax6 в раннем регенерате сетчатки, представленном слоем активно пролиферирующих нейробластов, дает дополнительные свидетельства участия Fgf2 в поддержании пролиферативной активности нейробластов сетчатки и экспрессии в них регуляторного гена Pax6. Локализация белка Otx2 в ядрах нейробластов сетчатки также позволяет предполагать участие данного транскрипционного фактора в регуляции пролиферации нейробластов зачатка сетчатки, как это показано в развитии сетчатки глаза других позвоночных (Martinez-Morales et al., 2001).

Мы показали, что на данной стадии регенерации процесс трансдифференцировки клеток РПЭ завершён и происходит их редифференцировка. Локализация белка Otx2 в ядрах клеток РПЭ указывает на участие данного транскрипционного фактора в регуляции дифференцировки этих клеток. При этом клетки РПЭ сохраняют способность воспринимать сигнал Fgf2.

В раннем регенерате сетчатки белок Pitx2 впервые обнаружен в популяции мультипотентных нейробластов и в отдельных клетках РПЭ и сосудистой оболочки (рис. 7). Эти результаты согласуются с данными о широком паттерне экспрессии гена Pitx2 в развивающемся глазу человека, и свидетельствуют о его многофункциональности (Маркитантова и др., 2006).

Локализация белков Fgf2, Fgfr, Pax6, Otx2 и Pitx2 в тканях глаза тритона на 50 сутки регенерации. На поздней стадии регенерации в зачатке сетчатки происходит дифференцировка нейронов и глии. В регенерате морфологически различимы основные клеточные слои (ганглиозный, внутренний и наружный ядерные слои, представленные биполярами и амакриновыми клетками, формируется слой фоторецепторов). Дифференцировка внутреннего и наружного сетчатых слоев, формирующихся при становлении синаптических связей, близка к завершению

В этот период белок Fgf2 локализован в цитоплазме, а его рецептор Fgfr - на поверхности дифференцирующихся клеток ганглиозного, внутреннего и наружного ядерных слоев сетчатки. Также мы обнаружили иммуноспецифический сигнал к Fgfr на поверхности клеток РПЭ и сосудистой оболочки (рис. 8).

Рис. 8. Локализация белков Fgf2 и Fgfr в тканях глаза тритона на 50 сутки регенерации сетчатки.

1 – слой ганглиозных клеток; 2 – внутренний сетчатый слой; 3 – внутренний ядерный слой; 4 – наружный сетчатый слой; 5– наружный ядерный слой; 6 – РПЭ.


Помимо белка Fgf2 в ганглиозных клетках и клетках внутреннего ядерного слоя выявляется белок Pax6 (рис. 9).

^ Рис. 9. Локализация белков Pax6, Otx2 и Pitx2 в тканях глаза тритона на 50 сутки регенерации сетчатки. 1 – слой ганглиозных клеток; 2 – внутренний ядерный слой; 3 – наружный ядерный слой; 6 – РПЭ.


Сходство локализации белков Fgf2 и Pax6 на стадии нейробластов и на стадиях активной дифференцировки клеток регенерирующей сетчатки согласуется с данными об участии этих генов в одном сигнальном пути (Spence et al., 2007). Выявленная на этой стадии в клетках РПЭ интенсивная иммуноспецифическая реакция к белку Otx2 свидетельствует о завершающемся процессе восстановления пигментного эпителия и накоплении в его клетках меланина (рис. 9). В зачатке сетчатки на этой стадии белок Otx2 локализуется в дифференцирующихся фоторецепторах, ганглиозных клетках, а также в некоторых клетках внутреннего ядерного слоя, предположительно, биполярах.

Наши данные согласуются с данными об участии Otx2, в контроле меланогенной дифференцировки клеток РПЭ и дифференцировки клеток сетчатки в развитии (Sakami et al., 2005; Koike et al. 2007). В дифференцирующемся регенерате сетчатки иммуноспецифическая реакция к Pitx2 наиболее ярко выражена в клетках ганглиозного слоя (рис. 9). Белок Pitx2 обнаружен также в ядрах клеток формирующихся внутреннего и наружного ядерных слоев сетчатки, а также в ядрах клеток ростовой области регенерирующей сетчатки (рис. 9). На исследуемой стадии регенерации сетчатки белок Pitx2 обнаружен в ядрах клеток восстанавливающегося РПЭ.

Заключение. При регенерации сетчатки у взрослых тритонов экспрессируются гены, кодирующие транскрипционные факторы Pax6, Otx2, Pitx2, Six3, а также сигнальный фактор Fgf2 и его рецепторы. Координированная работа этих генов обеспечивает не только развитие тканей глаза в эмбриогенезе, но и, согласно полученным нами данным, эпиморфную регенерацию сетчатки у Urodela. Исследуемые гены вовлечены в регуляцию клеточных процессов: от инициации и прогресса трансдифференцировки клеток пигментного эпителия – источника регенерации, до специализации клеток сформировавшегося регенерата сетчатки.

ВЫВОДЫ


  1. Впервые идентифицированы нуклеотидные последовательности участков мРНК генов Fgf2 и Pitx1 в геноме тритона Pl. waltl, имеющие высокую степень гомологии с последовательностями этих генов у высших и низших позвоночных, что свидетельствует об их консервативности.

  2. Впервые выявлена экспрессия регуляторного гена ^ Pitx1 как в интактной, так и в регенерирующей сетчатке глаза взрослого тритона.

  3. Выявлены отличия в экспрессии регуляторных генов Pax6 и Six3 между сетчаткой и пигментным эпителием глаза тритона в норме и на поздней стадии регенерации сетчатки (50 сут). В пигментном эпителии не экспрессируются регуляторные гены Pax6 и Six3.

  4. Начало трансдифференцировки клеток пигментного эпителия сопровождается активацией экспрессии гена ^ Pax6 и снижением уровня экспрессии генов Fgf2 и Otx2. На поздних стадиях трансдифференцировки пигментного эпителия уровни экспрессии генов Fgf2 и Pax6 возрастают. При редифференцировке клеток пигментного эпителия возрастает уровень экспрессии гена Otx2 и выключается экспрессия гена Pax6.

  5. Установлена локализация белка, кодируемого регуляторным геном Pitx2, в интактных тканях глаза тритона, а также на средней и поздней стадиях регенерации сетчатки (20 и 50 сут).

  6. Интактная и регенерирующая сетчатка на поздней стадии восстановления обладают сходным пространственным распределением регуляторных факторов Fgf2, Pax6, Otx2 и Pitx2.

  7. В ростовой зоне глаза, дополнительном источнике регенерации сетчатки, выявлены белки Fgf2, Pax6 и Pitx2.


Работа выполнена при использовании оборудования Центра коллективного пользования «По биологии развития на основе использования клеточных технологий и оптических методов» ОБН РАН при ИБР РАН.
^

Список работ, опубликованных по теме диссертации


  1. Авдонин П. П., Маркитантова Ю. В., Зиновьева Р. Д., Миташов В. И. Исследование экспрессии регуляторных факторов Pax6, Otx2, Six3, FGF2 в ходе регенерации сетчатки у тритонов // Изв. РАН. Серия биологическая. 2008. № 4. с. 355-361.

  2. Авдонин П.П., Григорян Э.Н., Маркитантова Ю.В. Транскрипционный фактор Pitx2: локализация при регенерации сетчатки у тритона // Изв. РАН. Серия биологическая. 2010. № 3. С. 283-288.

  3. Маркитантова Ю.В., Авдонин П.П., Григорян Э.Н., Зиновьева Р.Д. Идентификация в регенерирующей сетчатке тритона гена-регулятора эмбриогенеза Pitx1 // ДАН. 2010. Т. 435. № 3. С. 1–4.

  4. Маркитантова Ю.В., Фирсова Н.В., Авдонин П.П., Панова И.Г., Смирнова Ю.А., Зиновьева Р.Д. Исследования молекулярно-генетических основ развития и регенерации сетчатки позвоночных // Сб. «Пролиферативный синдром в офтальмологии». Москва. МЗСР РФ и РГМУ. 2008. С. 16-19.

  5. Авдонин П.П., Маркитантова Ю.В. Иммуногистохимическое исследование локализации регуляторных факторов FGF2, PAX6, OTX2 в ходе регенерации сетчатки взрослого тритона // Сб. «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино. 2009. С. 238-242.

  6. Маркитантова Ю.В., Авдонин П.П., Григорян Э.Н., Зиновьева Р.Д. Сетчатка взрослого тритона: исследование экспрессии регуляторных генов в ходе ее регенерации // Сб. "Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины". Ростов-на-Дону. 2009. С. 50-51.


Скачать 249.44 Kb.
Поиск по сайту:



База данных защищена авторским правом ©dogend.ru 2014
При копировании материала укажите ссылку
обратиться к администрации
Уроки, справочники, рефераты