Домой

Изучение белковых антигенов helicobacter pylori на основе моноклональных антител 03. 00. 04 биохимия 03. 00. 07 микробиология




Скачать 463.39 Kb.
НазваниеИзучение белковых антигенов helicobacter pylori на основе моноклональных антител 03. 00. 04 биохимия 03. 00. 07 микробиология
страница1/3
Дата26.01.2013
Размер463.39 Kb.
ТипАвтореферат
Содержание
1. Общая характеристика работы
Цель работы
Задачи исследования
Научная новизна.
Научно-практическая значимость работы.
Основные положения, выносимые на защиту.
Апробация диссертационной работы.
Объём и структура диссертации.
2. Материалы и методы исследования.
Бактериальные штаммы и антигены.
Элективная питательная среда для выделения и культивирования Helicobacter pylori.
Культивирование штаммов Helicobacter pylori.
Оценка качества среды.
Клеточные линии позвоночных.
Иммунизация лабораторных животных и получение поликлональной сыворотки.
Получение гибридных клеток.
Фракционирование и выделение белков Helicobacter pylori. Электрофорез белков в полиакриламидном геле.
Иммуноферментные методы.
Иммуноферментный анализ дот-блот.
Элюирование белкового антигена
...
Полное содержание
Подобные работы:
  1   2   3


На правах рукописи


Вечканов Евгений Михайлович


ИЗУЧЕНИЕ БЕЛКОВЫХ АНТИГЕНОВ

HELICOBACTER PYLORI

НА ОСНОВЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ


03.00.04 – биохимия

03.00.07 – микробиология


Автореферат

диссертации на соискание учёной степени

кандидата биологических наук


Ростов-на-Дону

2007

Работа выполнена на кафедре биохимии и микробиологии государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ростовский государственный университет» и в лаборатории «Гибридом» Федерального государственного учреждения здравоохранения Ростовского-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательского противочумного института Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.


Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Алексеева Л. П.

доктор биологических наук, профессор Лукаш А. И.


Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, доцент Терновская Л. Н.

доктор биологических наук, профессор Погорелова Т. Н.


Ведущая организация: Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт

эпидемиологии и микробиологии имени Пастера.

197101, Санкт-Петербург, ул. Мира, 14


Защита диссертации состоится: «26» апреля 2007 г. в 14-30 час на заседании диссертационного совета Д.212.208.07. по биологическим наукам в Южном Федеральном университете (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Большая Садовая, 105, актовый зал)


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Южного Федерального университета (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 148).


Автореферат разослан «21» марта 2007г.


Учёный секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук В. В. Бабенко


^ 1. Общая характеристика работы

Актуальность исследования.

Роль Helicobacter pylori в возникновении гастродуоденальной патологии считается доказанной и подтверждённой современными исследованиями микробиологов, клиницистов и эпидемиологов (Аруин Л. И., 1999). Ежегодные данные ВОЗ, свидетельствующие о стремительном расширении круга лиц, поражённых этим возбудителем, ставят проблему хеликобактериоза в один ряд с важнейшими проблемами мирового здравоохранения. Только в СНГ и России ежегодный прирост заболеваемости хроническими гастритами и язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки составляет более 1 млн. случаев, из которых от 60% до 90% составляют хеликобактер-ассоциированные. Особую значимость данной патологии придаёт официальная констатация Helicobacter. pylori как канцерогена I класса, иницирующего запуск патологических реакций, малигнизации тканей (ВОЗ., 1995).

Долгое время господствовала версия о паразитическом образе жизни Helicobacter. pylori в желудке человека. Однако, в настоящее время, господствующее положение постепенно приобретает версия о симбиотическом характере взаимоотношений человека и Helicobacter pylori. Несмотря на допускаемые симбиотические взаимоотношения человека и Helicobacter pylori, это микроорганизм всё же является одним из самых существенных факторов риска развития язвенной болезни желудка, язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, хронического гастрита, аденокарциномы желудка (Negrini R. et al., 1991). В связи с этим изменилось представление о методах лечения и диагностики этих заболеваний.

Разработано большое количество методов диагностики, позволяющих выявлять и идентифицировать этот микроорганизм. Развитие и усовершенствование этих методов помогло в получении ценной информации об эпидемиологии хеликобактериоза, сыграло большую роль в понимании патогенеза этой инфекции. Это, в свою очередь, позволило разработать наиболее эффективные схемы противохеликобактерной терапии и мероприятия, направленные на профилактику хеликобактериоза.

Ни один из существующих методов диагностики Helicobacter pylori - инфекции не универсален. Пределы возможностей этих методов могут быть ограничены не только их чувствительностью, но, зачастую зависят от возраста пациента, его индивидуальных особенностей, стадии заболевания, а также индивидуальных особенностей течения инфекции. Среди наиболее распространённых методов диагностики хеликобактерной инфекции выделяют: бактериологический, гистологический, уреазный тест, молекулярно-биологический (ПЦР-исследование), серологический методы. Все перечисленные методы имеют свои достоинства и недостатки. Из недостатков приведённых методов можно указать следующие: инвазивность, трудоёмкость и необходимость в специальном оборудовании для бактериологического метода, инвазивность и квалифицированные персонал для гистологического исследования, недостаточная чувствительность для уреазного теста, трудности в интерпретации значимости положительного результата в ПЦР-исследовании.

Для выделения и культивирования хеликобактерий в исследовательской практике используются различные питательные среды. Рецепты применяемых сред известны, однако их воспроизведение в лабораторных условиях затрудняется сложностью приобре­тения всего перечня добавок и факторов элективности. Трудновыполнимы также жесткие требования к газовой среде культивирования, которая должна состоять из 5% кислорода, 10% углекислого газа и 85% азота. Решению этих проблем служит разработанная в Ростовском ПЧИ питатель­ная среда для выделения и культивирования хеликобактерий элективная (СЭХ) (Ломов Ю. М., Харабаджахян Г. Д., Мазрухо А. Б., Шелохович А. И., 2000). В основу идеи создания среды заложен принцип полной комплектности препарата, гарантирующий оптимальный уровень его ростовых свойств. Оценка качества, элективных и ростовых свойств среды является важной составной частью успешной работы по выделению и наработке биомассы микроорганизма.

Среди диагностических методов особое место занимают серологические методы исследования. Одним из таких методов является метод обнаружения Helicobacter pylori с помощью моноклональных антител (МКА). Использование моноклональных антител, получаемых к белковым антигенам клеток Helicobacter pylori, является оправданным вследствие неинвазивности, чувствительности и специфичности тест-системы для обнаружения этого микроорганизма у пациента на их основе. Моноклональные антитела являются сегодня наиболее эффективным инструментом, с помощью которого возможно, с одной стороны, проведение тонких исследований антигенной композиции микробной клетки, выяснение функций отдельных антигенных детерминант, с другой - повышение чувствительности и специфичности серологического анализа, создание на их основе новых, более точных и быстрых методов идентификации и дифференциации.

Выяснение биологических и иммунохимических свойств антител и распознаваемых ими антигенов является необходимым условием их последующего успешного применения в диагностических целях, и нашей задачей было изучение свойств МКА, секретируемых гибридомой В10, полученной в лаборатории «гибридом» Ростовского противочумного института.


^ Цель работы:

Целью настоящего исследования явилось характеристика белковых антигенов Helicobacter pylori на основе моноклональных антител и определение возможности их использования для создания новой тест-системы по обнаружению данного микроорганизма.

^ Задачи исследования:

В работе были поставлены следующие задачи:

  1. Культивирование, получение колоний и наращивание биомассы микроорганизма Helicobacter pylori.

  2. Экспериментальная оценка элективной питательной среды для выделения и культивирования Helicobacter pylori (СЭХ), полученной в Ростовском НИПЧИ.

  3. Фракционирование и характеристика белковых антигенов методом электрофореза в полиакриламидном геле, денситометрии, спектрофотометрии и флуорометрии.

  4. Получение гибридом-продуцентов моноклональных антител к антигенам Helicobacter pylori и характеристика их свойств.

  5. Выявление белкового антигена Helicobacter pylori, против которого направлены моноклональные антитела гибридом-продуцентов.

  6. Выделение, очистка и характеристика препарата белкового антигена из клеток Helicobacter pylori путём гель-электрофореза и иммуноблоттинга с использованием полученных моноклональных антител.

  7. Исследование возможности использования полученных моноклональных антител в качестве основы тест-системы скрининга Helicobacter pylori – инфекции.

  8. Оценка диагностической значимости моноклональных антител в серологическом методе диагностики Helicobacter pylori – инфекции.

^ Научная новизна.

В результате проведённых исследований показана эффективность элективной питательной среды для культивирования микроорганизма Helicobacter pylori. Показана эффективность питательной среды в обеспечении ростовых свойств микроорганизма Helicobacter pylori. Питательная среда обладает элективностью в отношении энтеробактерий, дрожжевой флоры и про­тея, позволяя четко дифференцировать колонии возбудителя хеликобактериоза от сопутствующей микрофлоры.

В результате проведённых исследований созданы гибридомы-продуценты моноклональных антител, строго специфичных в отношении белковых антигенов микробных клеток Helicobacter pylori. Показано отсутствие перекрёстной активности моноклональных антител гибридомы В10 с микроорганизмами, имеющими антигенное родство с Helicobacter pylori.

Впервые методом иммуноблоттинга выявлен белковый антиген со средней молекулярной массой 30 ± 1 кДа, против которого направлены моноклональные антитела гибридомы В10. Выявленный белковый антиген был оценен как термолабильный, с типичной белковой формой УФ абсорбционного спектра и спектра флуоресценции, не содержит связанных липидов, углеводов и нуклеиновых кислот.

В теоретическом отношении полученные материалы расширяют имеющиеся представления о белково-антигенной организации Helicobacter pylori.

Впервые оценена возможность применения полученных моноклональных антител гибридомы В10 для изучения антигенной структуры штаммов Helicobacter pylori. и создания тест-системы скрининга Helicobacter pylori – инфекции.

^ Научно-практическая значимость работы.

В результате исследования показано, что использование среды СЭХ в практических медицинских учреждениях по­зволит значительно повысить эффективность исследования материала, подозри­тельного на обсемененность хеликобактериями.

Получена коллекция гибридных культур, продуцирующих моноклональные антитела к белковым антигенным детерминантам Helicobacter pylori, которая хранится в жидком азоте в библиотеке гибридом Ростовского противочумного института. Произведено депонирование гибридомы.

Характеристика моноклональных антител, продуцируемых гибридомой В10 и белков-антигенов Helicobacter pylori, явилась необходимой основой для оценки возможности создания тест-системы скрининга Helicobacter pylori – инфекции.

Материалы диссертации используются при чтении общего курса «Биотехнология» и спецкурса «молекулярная иммунология» на кафедре биохимии и микроюиологии Ростовского госуниверситета.

По материалам диссертации планируется создание и введение в клинико-лабораторную практику тест-системы скрининга Helicobacter pylori – инфекции.

^ Основные положения, выносимые на защиту.

  1. В результате проведённых исследований показана эффективность элективной питательной среды для культивирования микроорганизма Helicobacter pylori. Показана эффективность в обеспечении ростовых свойств микроорганизма Helicobacter pylori

  2. Охарактеризован фракционный состав белков Helicobacter pylori методами гель-электрофореза и денситометрии.

  3. Получен набор стабильных гибридных культур, продуцирующих моноклональные антитела к антигенным детерминантам Helicobacter pylori, не обладающих перекрёстной реактивностью с гетерологичными микроорганизмами. Среди полученного набора по оптимальным характеристикам отобрана для дальнейшего использования гибридная культура В10.

  4. Методом иммуноблоттинга идентифицирован белковый антиген, против которого направлены моноклональные антитела гибридомы В10. Проведено выделение данного белкового антигена. Антиген термолабилен, имеет молекулярную массу 30 ± 1 кДа, типичные белковые адсорбционные спектры и спектры флюоресценции, не содержит связанных липидов, углеводов и нуклеиновых кислот.

  5. Показана диагностическая значимость полученных моноклональных антител гибридомы В10.

^ Апробация диссертационной работы.

Материалы диссертации докладывались и обсуждались на научных конференциях биолого-почвенного факультета Ростовского государственного университета (Ростов-на-Дону, 2003-2006), а также были представлены на 2, 3, 4 международной межвузовской конференции молодых учёных «Обмен веществ при адаптации и повреждении» Ростовского государственного медицинского университета (Ростов-на-Дону, 2003-2005).

Материалы диссертации апробированы на совместном заседании кафедры биохимии и микробиологии Ростовского госуниверситета и лаборатории гибридом ФГУЗ «Ростовского противочумного института»

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, из них две в центральной печати. Личный вклад автора 100%.

^ Объём и структура диссертации.

Диссертация изложена на 155 страницах, включая библиографию. Работа состоит из введения и 4 глав: обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов, списка использованной литературы. Библиографический указатель включает 142 источника, из них 73 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 35 рисунками и 20 таблицами.

^ 2. Материалы и методы исследования.

Лабораторные животные.

В работе использовали белых мышей-самок инбредной линии BALB/c в возрасте 6-10 недель с целью получения иммунных спленоцитов и перитонеальных макрофагов, индукции асцитных опухолей.

^ Бактериальные штаммы и антигены.

В качестве источника микроорганизма Helicobacter pylori использовали референтные штаммы Helicobacter pylori NCTS 11637, полученные из музея живых культур из числа имеющихся в ГИСК им. Л.А.Тарасевича, и 4 штамма хеликобактерий, выделенные в РПЧИ из биоптатов слизистой оболочки желудка больных гастритом и язвенной болезнью. Наращивание биомассы микроорганизма и получение колоний осуществляли на питательной среде для выделения и культивирования возбудителя хеликобактериоза, разработанной в РПЧИ.

^ Элективная питательная среда для выделения и культивирования Helicobacter pylori.

Среда СЭХ пред­ставляет собой комплект, включающий основу среды в стерильной агаризованной форме в бутылях БКЗ-450 и добавки (стимуляторы роста и смесь антибиотиков).

^ Культивирование штаммов Helicobacter pylori.

Тест-штаммы выращивались в течение 72 ч при 37°С в микроанаэростате с трёхкомпонентной газовой средой (5% кислорода, 10% углекислого газа, 85% азота) на среде СЭХ. Для получения кокковидной формы микроорганизма, выращенные культуры дополнительно оставляли на 72 ч при 37°С.

^ Оценка качества среды.

Для проверки ингибирующих свойств среды использовали следующие тест-штаммы: Е. coli АТСС 25922, S. sonnei 10391, S. flexneri I A 8516, S. typhi 10476 С. albicans АТСС 24433, P. vulgaris NCTC 3132.

^ Клеточные линии позвоночных.

В работе использовались мышиные миеломные клетки NS0. Культивирование мышиных миеломных клеток NSO проводили в ростовой среде RPMI-1640, дополненной 10% сыворотки плода коровы (СПК), 2mМ L-глутамина и 10 mМ Hepes.

^ Иммунизация лабораторных животных и получение поликлональной сыворотки.

Мышей иммунизировали микробными клетками H. рylori, убитых мертиолятом (0,01%). Иммунизацию мышей проводили по следующей схеме: каждому животному трехкратно с интервалом две недели вводили внутрибрюшинно в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ) 0,1 мл инактивированной взвеси H. pylori (108 клеток/мл, то есть 107 клеток/мышь).

^ Получение гибридных клеток.

Слияние селезеночных клеток мыши с миеломой NS0 проводили в соответствии с методикой, описанной Fazekas et al (1980). Определение антителопродукции гибридом проводили методом ТИФА. Клонирование и реклонирование клеточных культур осуществляли методом предельного разведения (Goding, 1986).

^ Фракционирование и выделение белков Helicobacter pylori. Электрофорез белков в полиакриламидном геле.

Электрофорез белков в комплексе с SDS проводился в системе, предложенной Лэммли (Laemmli, 1970). Визуализацию результатов электрофореза осуществляли путём окраски геля Coomassie brilliant blue и «Stains-all».

^ Иммуноферментные методы.

Для обнаружения МКА в супернатантах гибридом применялся твердофазный иммуноферментный анализ. Тестирование осуществляли иммуноферментным набором для скрининга гибридом (Calbiochem).

^ Иммуноферментный анализ дот-блот.

Проводился аналогично ТИФА, но на нитроцеллюлозе. Результат реакции учитывали визуально (Нго и соавт., 1988).

Метод непрямой иммунофлюоресценции моноклональных антител (НИФМ).

Мазки Helicobacter pylori обрабатывались нефлюоресцирующими антителами и далее флуоресцирующей антиглобулиновой сыворотко. Препараты просматривались в люминесцентном микроскопе.

Иммуноблоттинг

Осуществляли в течение 25 мин, с ограничением по току 2мА/см2. Визуализацию белковых фракций осуществляли Ponceau. Инкубацию иммуноблота осуществляли в растворе моноклональных антител 1:100, 1:250, 1:500. В качестве вторичных антимышиных иммуноглобулинов использовался готовый набор, коанъюгированных с пероксидазой хрена - Goat Anti-Mouse Immunoglobulins-Peroxidase Conjugate Calbiochem® Immunochemicals.
  1   2   3

Скачать 463.39 Kb.
Поиск по сайту:



База данных защищена авторским правом ©dogend.ru 2014
При копировании материала укажите ссылку
обратиться к администрации
Уроки, справочники, рефераты